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Comparative investigations of different in situ hybridization methods and detection of novel viral agents causing central nervous system diseases / by Dr. Vanessa Maria Pfankuche

In situ-Hybridisierung (ISH) stellt eine nützliche Methode zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren in verschiedenen Gewebeproben dar. Die Ziele der vorliegenden Studie sind (i) der Vergleich dreier verschiedener ISH-Methoden in ihrer Effektivität verschiedene Viren zu detektieren und (ii) die Anwen... Full description

PPN (Catalogue-ID): 1026007542
Personen: Pfankuche, Vanessa Maria [VerfasserIn]
Baumgärtner, Wolfgang [Akademischer betreuerIn]
Tipold, Andrea [Akademischer betreuerIn]
Schughart, Klaus [Akademischer betreuerIn]
Format: eBook eBook
Language: English
Zusammenfassungen in deutscher und englischer Sprache
Published: Hannover, 2018
Hochschule: Dissertation, Tierärztliche Hochschule Hannover, 2018
Basisklassifikation: 46.03
Subjects:

In-situ-Hybridisierung / Viren

Formangabe: Hochschulschrift
Physical Description: 1 Online-Ressource (iv, 110 Seiten, 2.500 KB)

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520 |a In situ-Hybridisierung (ISH) stellt eine nützliche Methode zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren in verschiedenen Gewebeproben dar. Die Ziele der vorliegenden Studie sind (i) der Vergleich dreier verschiedener ISH-Methoden in ihrer Effektivität verschiedene Viren zu detektieren und (ii) die Anwendung erhobener Daten zum Nachweis neuartiger sowie neu aufkommender und wieder-aufflammender Krankheitserreger. Der erste Teil der Arbeit konzentriert sich auf eine vergleichende Studie dreier ISH-Techniken zum Nachweis 8 verschiedener Viren in unterschiedlichen Geweben [5 RNS-Viren: atypisches porzines Pestivirus (APPV) im Kleinhirn von Schweinen, bovines Hepacivirus (BovHepV) in der Leber von Rindern, equines Hepaciviurs (EqHV) in der Leber von Pferden, Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) in der Nase von Kamelen, Schmallenberg-Virus (SBV) im Großhirn von Ziegen und 3 DNS-Viren: kanines Bocavirus (CBoV-2) im Darm von Hunden, porzines Bocavirus (PBoV) im Rückenmark von Schweinen und porzines Circovirus 2 (PCV-2) in der Lunge, dem Lungenlymphknoten und dem Großhirn von Schweinen]. Die Vergleichsmethoden umfassen (i) chromogene ISH (CISH) unter Verwendung von selbst entworfenen und synthetisierten Digoxigenin (DIG)-markierten RNS-Sonden unter Verwendung des pCR4-TOPO-Vektors zum Nachweis von RNS- und DNS-Viren, (ii) CISH unter Verwendung von DIG-markierten kommerziell hergestellten RNS- (equines Hepacivirus) oder DNS-Sonden (DNS-Viren) und (iii) fluoreszierende ISH (FISH) unter Verwendung kommerziell erhältlicher RNS-Sonden-Mixe (Thermo Fisher Scientific) zur Detektion von RNS- und DNS-Viren. Die RNS-Sonden-Mixe detektierten 7 von 8 Viren (87,5 %), jedoch waren sie nicht in der Lage MERS-CoV in entkalktem Nasengewebe eines Kamels nachzuweisen. Die selbst entworfenen RNS-Sonden detektierten 50% der getesteten Viren, 2 RNS- und 2 DNS-Viren. Die kommerziell produzierten DNS-Sonden detektierten 66,67% der DNS-Viren, allerdings konnten die EqHV-spezifischen RNS-Sonden das Virus nicht nachweisen. SBV, CBoV-2 und PCV-2 konnten von allen getesteten Sonden nachgewiesen werden. Zur Berechnung der zellassoziierten, positiven Fläche wurden Gesamtflächen des Gewebes pro Objektträger und die zellassoziierten positiven Bereiche gemessen. Aus den Ergebnissen wurde der Prozentsatz der positiven Fläche berechnet. Für CBoV-2 und PCV-2 war die größte positive Fläche unter Verwendung des RNS-Sonden-Mixes zu beobachten. Im Gegensatz dazu, wurde für SBV die größte Fläche im Großhirn einer SBV-positiven Ziege unter Verwendung der anti-sense RNS-Sonde gemessen. Die Materialkosten, die bei der ISH mittels DIG-markierter Sonden, sowohl selbst entworfener RNS als auch die kommerziell hergestellter RNS- und DNS-Sonden, inklusive Sondensynthese und ISH, entstehen, belaufen sich auf 10,-€ pro Schnitt. Im Gegensatz dazu kostet ein Objektträger mit dem RNS-Sonden-Mix, der eine hohe Sensitivität zeigte, mindestens 60,-€. Die benötigte Zeit wurde nach drei Auswertungskategorien berechnet, (i) die reine Arbeitszeit (ii) die Arbeitszeit einschließlich Inkubationszeiten und (iii) die benötigte Zeit in Tagen beginnend mit der Sonden-, Kit- und Plasmid-Bestellung. In Bezug auf die Arbeitszeit ohne und mit Inkubationszeiten ist der kommerziell erhältliche RNS-Sonden-Mix mit 3 bzw. 13 Stunden das schnellste System. Dies stellt außerdem einen kostensparenden Aspekt dar. Der größte Nachteil dieser Methode sind allerdings lange Bestellzeiten von 21 Tagen. Im Gegensatz dazu dauert eine ISH mit kommerziell produzierten oder selbst gebauten Sonden etwa 10 bzw. 16 Tage. Abschließend lässt sich sagen, dass die ISH eine sehr hilfreiche Methode für die Entdeckung neuartiger Viren darstellt. Allerdings ist die Wahl, der am besten geeigneten ISH-Technik, sehr fallabhängig, da Faktoren wie Zeit, Kosten und Sensitivität zwischen den verschiedenen Techniken, Viren und Geweben variieren. Allerdings zeigte der RNS-Sonden-Mix im Nachweis der getesteten Viren die höchste Detektionsrate. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit dem Nachweis von PBoV im Rückenmark eines Schweins mit Enzephalomyelitis unter Verwendung von next generation sequencing (NGS) und FISH. Dies ist der erste Bericht von PBoV im zentralen Nervensystem (ZNS) von Schweinen. Interessanterweise wurde aus dem Liquor von Menschen mit Enzephalitiden bereits ein humanes Bocavirus isoliert. Die Verwendung von FISH zeigt den Neurotropismus von PBoV, da virale Nukleinsäuren innerhalb des Zytoplasmas und des Zellkerns von Neuronen detektiert wurden. Da die Isolierung von PBoV fehlschlug und die Koch´schen Postulate damit nicht zu erfüllen sind, wurde die FISH verwendet, um eine Korrelation aus Läsion und Virus herzustellen, die deutlich auf die Pathogeniät von PBoV hinweist. Der dritte Teil beschreibt den Nachweis des felinen Panleukopenie-Virus (FPV) im ZNS einer Katze mit klinischer Ataxie und histologisch nachgewiesenen intraneuronalen Vakuolen. FPV wurde bereits in Neuronen bei Katzen nachgewiesen. Allerdings deutet der in situ-Nachweis viraler Nukleinsäuren und Proteine mittels CISH und Immunhistochemie in vakuolisierten Neuronen, in Gliazellen und in Endothelzellen auf ein neues Manifestationsmuster von FPV bei Katzen hin, da FPV-Infektionen des felinen ZNS meist auf zerebelläre Missbildungen beschränkt sind. Der vierte Teil befasst sich mit dem Nachweis und der Visualisierung des Batai-Virus im ZNS eines Seehundes mit Meningoenzephalomyelitis unter Verwendung von Virusisolation, NGS und FISH. Virale Nukleinsäuren wurden in verschiedenen ZNS-Arealen, wie dem Großhirn, dem Kleinhirn und dem Rückenmark nachgewiesen. Außerdem wurde Batai-Virus in der Tunica mucosa des Dünndarms und in kortikalen und medullären Lymphozyten des Lungenlymphknotens beobachtet. Eine RT-PCR bestätigte die Ergebnisse, da die höchste Viruslast im ZNS, gefolgt vom Darm gefunden wurde. Eine ISH am ZNS 8 weiterer Seehunde mit ähnlichen histopathologischen Veränderungen verlief mit negativem Ergebnis. Allerdings zeigte ein anderer Seehund desselben Zoos, der 2 Monate zuvor an akutem Nierenversagen verstarb, ein positives Batai-Virus spezifisches Signal in den Glomerula und den renalen Tubulusepithelzellen, in der Tunica mucosa des Dünndarms und in kortikalen und medullären Lymphozyten des Lungenlymphknotens. Zusammengefasst stellt der vorliegende Fall die erste beschriebene Batai-Virus assoziierte ZNS-Erkrankung eines natürlich infizierten Säugetieres und den ersten dokumentierten Fall einer Batai-Virusinfektion eines marinen Säugers dar. Daher sollten Batai-Viren als neurotrope Viren bei Seehunden in Betracht gezogen werden. Der fünfte Teil beschreibt den Nachweis von APPV in mehreren Organen von Ferkeln mit kongenitalem Tremor. Mittels Luxol-Fast-Blau-Färbung war eine geringgradig reduzierte Färbeintensität in der lateralen weißen Substanz des Rückenmarks bei 4 von 6 erkrankten Ferkeln zu beobachten, während die gleichaltrigen, klinisch unauffälligen Kontrolltiere eine reguläre Myelinisierung aufwiesen. Eine FISH zeigte, dass APPV im ZNS einen Tropismus für Neuronen der inneren Körnerzellschicht des Kleinhirns hat. Nichtsdestotrotz waren im Kleinhirn positiver Ferkel keine histomorphologischen Veränderungen zu beobachten. Allerdings wiesen die APPV-positiven Ferkel klinische Anzeichen von kongenitalem Tremor auf. Diese Beobachtung unterstreicht die Rolle von APPV bei der Entwicklung von kongenitalem Tremor. Im sechsten Teil der Arbeit wurde im Lebergewebe von Tinamus mit nekrotisierender Hepatitis ein aviäres Hepadnavirus nachgewiesen. Mittels FISH zeigten sich intraläsional virale Nukleinsäuren, sodass dem aviären Hepadnavirus eine Rolle bei der Entwicklung nekrotisierender Hepatitiden zugeschrieben werden sollte. Darüber hinaus wurden virale Nukleinsäuren in den Nieren und Hoden eines Tinamus nachgewiesen. Diese Beobachtung deutet auf eine Virämie hin. Obwohl eine Virämie für Hepadnaviren beschrieben ist, war das ZNS allerdings negativ für das aviäre Hepadnavirus. Der siebte Teil der Arbeit beschreibt die Untersuchung auf verschiedene Pathogene bei Fü... 
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