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Gewinnung und gentechnische Modifizierung einer rekombinanten Phospholipase A2 zur industriellen Anwendung / von Yvonne Markert

Phospholipase, Gensynthese, rekombinante Proteingewinnung, Rückfaltung, Stabilität, Disulfidbrücken, ortsgerichtete Mutagenese

PPN (Catalogue-ID): 394130170
Personen: Markert, Yvonne
Format: eBook eBook
Language: German
Sprache der Zusammenfassung: Englisch
Published: 2004
Edition: [Elektronische Ressource]
Hochschule: Halle, Univ., Diss., 2004
Basisklassifikation: 35.74
58.30
Formangabe: Hochschulschrift
Physical Description: Online-Ressource, Text + Image

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520 |a Phospholipasen A2 (PLA2) spielen eine entscheidende Rolle bei der Produktion von Lysophospholipiden. Gegenwärtig wird die PLA2 aus dem Schweinepankreas für diese Applikation eingesetzt. Um das Enzym aus dem Schweinepankreas ersetzen zu können, wurde ein synthetisches Gen erzeugt, welches sich von der PLA2 aus der Honigbiene ableitet. Das synthetische Gen wurde in Escherichia coli exprimiert. Da die Expression mit einer Leadersequenz, die zur Sezernierung des Proteins ins Periplasma führen sollte, scheiterte, wurden vier Genvarianten hergestellt und exprimiert, deren N-terminale Sequenz modifiziert wurde. Alle Varianten wurden in Form von inclusion bodies mit einer Ausbeute von 26 bis 35% als Anteil am Gesamtzellprotein exprimiert. Nach der Optimierung der Renaturierung wurden die rekombinanten Proteinspecies durch Kationenaustauschchromatographie (Mono S) gereinigt. Alle Varianten waren katalytisch aktiv. Die rekombinanten PLA2-Formen zeigten eine dem Bienengiftenzym vergleichbare Struktur (Fern-UV-CD-Spektren, Fluoreszenzemissionsspektren). Die thermodynamische Stabilität der rekombinanten PLA2s im Vergleich zum Bienengiftenzym zeigt keine gravierenden Unterschiede. Nach der Optimierung des Expressionsprozesses in Schüttelkolben wurde ein Scale up der Produktion durch Hochzelldichtefermentation im 10 Liter Maßstab durchgeführt. Um den Einfluss der individuellen Disulfidbrücken auf die Proteinstabilität sowie Aktivität zu überprüfen, wurden Enzymvarianten erzeugt, in denen jeweils zwei Cysteinreste, die in der natürlich vorkommenden PLA2 Disulfidbrücken bilden, durch Serinreste ersetzt. Mit Ausnahme der Cysteinmutanten I1A/C9S/C31S-PLA2 I1A/C61S/C95S-PLA2 zeigten alle Mutanten nur einen moderaten Aktivitätsverlust. Beim Vergleich der Stabilität der Cysteinmutanten mit dem Wildtyp ergaben sich in Abhängigkeit von der Lokalisation der Disulfidbrücke sehr distinkte Stabilitätsunterschiede. Die Entfernung einer Disulfidbrücke führt zu einer unterschiedlich stark ausgeprägten Destabilisierung bei weitgehend erhaltener Kooperativität der Übergänge. 
520 |a In industry phospholipases A2 (PLA2) play an important rule for the production of lysophospholipids. At present, PLA2 from porcine pancreas is the preferred catalyst for these applications. To make accessible an non-mammalian source of the enzyme to industrial application, we constructed a synthetic gene coding for PLA2 from honey bee and expressed it in Escherichia coli. While expression of the gene with an N-terminal leader sequence to direct the protein into the periplasm failed, four variants with modified N-termini were successfully expressed. In all cases, the protein is produced as insoluble inclusion bodies and amounts to 26-35% of total cell protein. The renaturation of the protein was optimized and yielded active enzyme which was purified to homogeneity by cation-exchange chromatography on MonoS columns. The homogeneous recombinant PLA2 preparations show similar structure (Far-UV CD-spectra and fluorescence emission spectra) in comparison to commercially available PLA2 isolated from the venom glands of honey bee (bv-PLA2). The thermodynamic stabilities of the recombinant enzymes calculated from the transition curves in guanidine hydrochloride were also nearly identical to the stability of bv-PLA2. For the variant I1A-PLA2 a scaling up of the enzyme production was obtained by high-cell density fermentation in 10 L-scale. To analyse the impact of the five disulfide bonds of the molecule on its activity and stability, additional variants lacking one of the cystine residues each were produced. With the exception of I1A/C9S/C31S-PLA2 and I1A/C61S/C95S-PLA2, the activity losses of the variants were moderate. The conformational transitions of the variants in the denaturation by guanidine hydrochloride showed distinct differences in the transition midpoint concentrations enabling a fine tuning of PLA2 stability. 
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