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Identification and characterization of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis milk in Northern Germany / submitted by Omar Hashim Sheet

Der LAMP-Assay (Loop-Mediated Isothermal Amplification) wird al seine der effizientesten Methoden erachtet, tierische und humane, pathogene Keime zu detektieren, da damit unter isothermalen Bedingungen DNS schnell und mit hoher Effizienz und Spezifität amplifiziert werden kann. S. aureus ist einer d... Full description

PPN (Catalogue-ID): 878178953
Personen: Sheet, Omar Hashim [VerfasserIn]
Klein, Günter [Akademischer betreuerIn]
Format: eBook eBook
Language: English
Zusammenfassungen in deutscher und englischer Sprache
Published: Hannover, Tierärztliche Hochschule Hannover, 2016
Hochschule: Dissertation, Tierärztliche Hochschule Hannover, 2016
Basisklassifikation: 46.54
46.03
Subjects:

Genamplifikation / Staphylococcus aureus / Euterentzündung / Milchkuh

Phänotyp / Genotyp / Staphylococcus aureus / Euterentzündung / Milchkuh

Formangabe: Hochschulschrift
Physical Description: 1 Online-Ressource (XIV, 198 Seiten, 15.662 KB)

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520 |a Der LAMP-Assay (Loop-Mediated Isothermal Amplification) wird al seine der effizientesten Methoden erachtet, tierische und humane, pathogene Keime zu detektieren, da damit unter isothermalen Bedingungen DNS schnell und mit hoher Effizienz und Spezifität amplifiziert werden kann. S. aureus ist einer der wichtigsten Krankheitserreger, der Mensch und Tier gleichermaßen betreffen kann. Bei Milchrindern stellt die Mastitis durch S. aureus einen wichtigen wirtschaftlichen Faktor dar, und die Herdenbetreuung hinsichtlich der Eutergesundheit hängt von einer schnellen und korrekten Erregerabklärung ab. Die vorliegende Studie bestand aus zwei Teilen: Erstens die Entwicklung und Validierung eines neuen LAMP assay für den Nachweis von S. aureus und zweitens die phänotypische und genotypische Charakterisierung von S. aureus aus Mastitismilch. Das „Loop-Mediated Isothermal Amplification assay“ ist eine breitanzuwendende und innovative Methode für die Gen-Amplifikation. Sie wird als leicht durchzuführende und schnelle diagnostische Methode betrachtet, welches eine hohe Spezifität und Sensitivität für die Erkennung und Identifizierung von Pathogenen aufweist. In dieser Studie wurde auf der Basis des nuc-Gens ein LAMP-Assay für die Identifizierung von S. aureus entwickelt und validiert. Die Spezifität des LAMP-Assays wurde anhand von 70 S. aureus-Isolaten bestätigt. Die Proben bestanden aus bovinen Mastitis-Milchproben, die in der Zeit von August 2001 bis März 2014 aus verschiedenen Regionen in Norddeutschland gesammelt wurden. Des Weiteren wurden 21 Bakterienstämme gesammelt, die nicht von S. aureus stammen. Die Ergebnisse des LAMP-Assays ermöglichten einen Nachweis des nuc-Gens in allen untersuchten S. aureus-Isolaten (100%), während es kein Signal bei einem der getesteten Nicht-S. aureus-Stämme gab. Die analytische Sensitivität des entwickelten LAMP-Assays betrug 0,25 pg von der S. aureus-DNA pro Reaktion. Die Nachweisgrenze betrug 9×102 CFU mL-1. Um die Nachweisgrenze zu bestimmen, wurde herkömmliche Milch mit S. aureus künstlich kontaminiert. Das entwickelte LAMP-Assay ist eine schnelle Nachweismethode für die Identifizierung von S. aureus, welcher eine hohe Speziftät und Sensitivität aufweist. Das Real-Time-Fluorometer ermöglicht eine Identifizierung von S. aureus in weniger als zwei Stunden (einschließlich der DNA-Extraktion). Deshalb ist diese Methode eine schnelle, flexible und einfache Methode, um S. aureus nachzuweisen. Um die molekulare Ökologie von S. aureus zu verstehen, wurden in dieser Studie die phänotypischen und genotypischen Merkmale von 70 S. aureus-Isolaten verglichen. Alle S. aureus-Isolate wurden phänotypisiert. Außerdem wurde ihre genetische Vielfalt anhand der „multilocus sequence typing“-Methode (MLST) und der „Staphylokokken Protein (spa) typing“-Methode charakterisiert. Für die Anwesenheit von virulententen Genen wurden 16 Staphylokokken-Enterotoxine (sea-selu), das „Toxic-Shock-Syndrom-Toxin“ (tst), die Thermonuklease (nuc), der Clumping-Faktor (clfA und clfB), die Koagulase und das Methicillin-resistente-Gen mecA kodiert. Außerdem wurde die vorliegende Studie durchgeführt, um die Beziehungs zwischen S. aureus-Isolaten mit dem Profil von 118 menschlichen S. aureus Stämmen in Deutschland und dem Profil von 33 S. aureus-Stämmen von boviner Mastitis aus verschiedenen europäischen Länden festzustellen. Der „Staphaurex-Test“ (Clumping Faktor und Protein A) zeigte, dass 75,7% der Isolate positiv waren. Weiterhin reagierten alle untersuchten Isolate im Katalase-Test positiv. Das „API 32 Staph identifikation system“ bestätigte, dass alle Isolate auch S. aureus waren. Gemäß dem „antimicrobial susceptibility–Test“ waren alle untersuchten S. aureus-Isolate sensitiv gegenüber Methicillin, wohingegen die Isolate eine hohe Resistenz gegenüber Penicillin und Ampicillin zeigten. Durch die MLST-Analyse konnten 16 verschiedene Sequenz-Typen (ST) ermittelt werden. Sechs von diesen waren neue STs, welche als ST2821, ST2823, ST2824, ST2825, ST2826 und ST2827 bezeichnet wurden. Insgesamt wurden 16 Sequenz-Typen in acht „clonal complex“ (CCs) unterteilt. Weiterhin wurden siebzehn verschiedene spa-Typen identifiziert und ein neuer spa-Typ (t13769) gefunden. Die Prävalenz des Entertoxin-Gens von S. aureus, welche durch die PCR-Methode ermittelt wurde, zeigte, dass der größte Teil der Isolate für mehr als ein Enterotoxin-Gen positiv war. Andere Isolate besaßen kein Enterotoxin-Gen. Außerdem zeigten die S. aureus-Isolate neun verschiedene enterotoxische Profile. Von den Sequenz-Typen der bovinen Mastitis-Milch gehörte ein Großteil zu den „clonal complex“ CC5, CC97, CC133 und CC151. Dieses zeigte ein enge Verbindung zu den Genotypen oder Abstammungslinien von den Sequenz-Typen menschlicher Herkunft. Die genotypische Charakterisierung von S. aureus, welches aus boviner Mastitismilch isoliert wurde und mittels MLST und spa-typing ermittelt wurde, zeigte, dass die Infektionen in den Kuhherden aus verschiedenen Regionen in Norddeutschland durch zahlreiche Klone verursacht wurden. Diese Klone waren eng mit anderen Stämmen aus verschiedenen Regionen der Welt verwandt. Die Identifizierung von neuen STs und neuen spa-Typen in einigen Isolaten, unterstreicht die Wichtigkeit solcher Studien in Kühen, da sich die Hinweise auf eine direkte Übertragung von S. aureus zwischen Milchkühen und Menschen häufen. Die in der vorliegenden Studie entwickelten minimal aufspannenden Bäume unterstützen diese Annahme und eröffnen neue Möglichkeiten, tierische und menschliche Stämme unter epidemiologischen Gesichtspunkten zu verbinden. 
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