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Etablierung einer primären bovinen Hepatozytenzellkultur als Modell zur Untersuchung der Expression des Wachstumshormonrezeptors / vorgelegt von Sonja Ehrhardt

Es ist bekannt, dass es in der Hochträchtigkeit von Milchkühen in den letzten Wochen ante partum zu einer hepatischen Wachstumshormon-Resistenz kommt, bei der die Ansprechbarkeit des GH auf den GHR sinkt, so dass es zu einem Absinken der IGF-I- Konzentration kommt (Piechotta et al., 2014; Radcliff... Full description

PPN (Catalogue-ID): 890945292
Personen: Ehrhardt, Sonja [VerfasserIn]
Schmicke, Marion [Akademischer betreuerIn]
Format: eBook eBook
Language: German
Zusammenfassungen in deutscher und englischer Sprache
Published: Hannover, Tierärztliche Hochschule Hannover, 2017
Hochschule: Dissertation, Tierärztliche Hochschule Hannover, 2017
Basisklassifikation: 46.80
44.89
Subjects:

Leberepithelzelle / Somatotropin / Rezeptor / Rind

Formangabe: Hochschulschrift
Physical Description: 1 Online-Ressource (VIII, 149 Seiten, 3.543 KB)

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520 |a Es ist bekannt, dass es in der Hochträchtigkeit von Milchkühen in den letzten Wochen ante partum zu einer hepatischen Wachstumshormon-Resistenz kommt, bei der die Ansprechbarkeit des GH auf den GHR sinkt, so dass es zu einem Absinken der IGF-I- Konzentration kommt (Piechotta et al., 2014; Radcliff et al., 2003a). Bislang konnte am Tiermodell nicht hinreichend geklärt werden, welche Faktoren zu dieser reduzierten GHR Expression führen. Es ist hinreichend beschrieben, dass es im peripartalen Zeitraum der Milchkuh zu enormen endokrinen, immunologischen und metabolischen Veränderungen kommt. Ziel dieser Arbeit war es daher, ein in vitro Modell zu etablieren, um zukünftig gezieltere Untersuchungen am GHR und dessen Regulationsmechanismen zu ermöglichen. Aus Aspekten des Tierschutzes sowie aus Kostengründen wurde sich für die Etablierung einer Zellkultur aus Schlachthofmaterial entschieden, um Tierversuche, gerade da es sich hier um große Nutztiere handelt, zu reduzieren. In dieser Arbeit wurde ein Protokoll zur Isolation der primären bovinen Hepatozyten sowie der folgenden Kultivierung der Zellen etabliert. Ein Vorversuch mit frisch isolierten Rattenhepatozyten nach gut etabliertem Protokoll wurde durchgeführt, um später die Expressionen von GHR1A und IGF-I, aber auch die Morphologie der Ratten- und bovinen Zellen miteinander vergleichen zu können. Für die Etablierung des Perfusionsprotokolls für die Rinderleber wurden insgesamt 38 Leberstücke perfundiert. Während der Etablierungsphase wurden einige Modifikationen zum Ausgangsprotokoll durchgeführt. Das verwendete Ausgangsprotokoll bildete hier ein gut etabliertes Protokoll zur Isolation humaner primärer Hepatozyten der Charité Berlin. Dieses basiert auf der Grundlage einer Two-Step-Kollagenaseperfusion nach Seglen (1972). Nach etabliertem Endprotokoll wurden in dieser Arbeit 13 Leberstücke perfundiert. Die Vitalität der isolierten bovinen Hepatozyten lag im Mittel bei 60,5% ± 9,6 bei einer mittleren Zellausbeute von 5,1x106 Zellen/ml Zellsuspension. Diese Werte liegen im Vergleich zu anderen Arbeiten zur Isolation primärer boviner Hepatozyten aus Schlachthofmaterial etwas niedriger (Giantin et al., 2012; Panda et al., 2015). Unterschiede zur eigenen Arbeit finden sich vor allem in der Pufferzusammensetzung und der Technik der Perfusion, obwohl beide Autoren ebenfalls eine modifizierte Two-Step-Kollagenaseperfusion anwenden. Die Kultivierung der bovinen Hepatozyten erfolgte in dieser Arbeit vergleichend im Monolayer und in der Sandwich Kultur als dreidimensionales Kultursystem. Anhand einer Lebend/Tot Färbung konnte an den Versuchstagen die Vitalität der Zellen gut mikroskopisch analysiert, und die jeweiligen morphologischen Veränderungen festgestellt werden. Anhand der morphologischen Ergebnisse sowie der Laboranalysen der Parameter Harnstoff, LDH und der Apoptosemarker BAX und FasL kann in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Sandwich Kultur der Monolayer Kultur in der Vitalität der Zellen überlegen ist. In der Sandwich Kultur konnten über 14 Tage vitale Zellen nachgewiesen werden. Nach dieser Zeit wurde der Versuch beendet. Allerdings wurden auch in der Monolayer Kultur bis zu Tag 10 vitale Zellen detektiert. Laut Literaturangaben spielt die Ausprägung von Zell-Zellkontakten sowie einer charakteristischen polygonalen Zellmorphologie eine entscheidende Rolle für die Differenzierung der Hepatozyten in der Kultur, und somit auch für die Ausübung hepatozytenspezifischer Funktionen (Vinken et al., 2006). In der eigenen Arbeit konnten in der Sandwich Kultur diese morphologischen Charakteristika nachgewiesen werden, wodurch auf eine Funktionalität der Hepatozyten spekuliert werden kann. Da die etablierte Zellkultur zukünftig als Grundlage für Studien am GHR verwendet werden soll, wurden die Expressionen der mRNA von GHR1A und IGF-I analysiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Expression des GHR sowohl bei Ratten- als auch bei Rinderhepatozyten zunächst deutlich sinkt und in der Sandwich Kultur ab Tag 3 langsam ansteigt. Auf der Grundlage dieser Arbeit kann in weiterführenden Arbeiten die Vitalitätsrate der bovinen Hepatozyten während der Isolation und der Kultivierung durch Modifikationen noch erhöht werden. 
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